2018-12-20 点击:

作者:张博睿
  【摘要】为了鉴定分析球囊菌(Ascosphaera apis)几丁质酶基因分子特征,预测其编码蛋白的生物学功能,本实验对球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578进行了PCR扩增,应用生物信息学方法对其编码氨基酸序列进行分析,预测编码蛋白的三级结构。结果显示, Am-KZZ89578基因全长958bp, 编码 421个氨基酸。多重序列比对和系统进化分析表明,Am-KZZ89578蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅲ亚家族成员,该蛋白的预测三级结构呈弯曲螺旋结构形式。本实验结构为球囊菌几丁质酶基因编码蛋白的生物学功能研究提供了基础参考。
  【关键词】球囊菌 几丁质酶 基因 PCR
  【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089(2018)37-0131-03
  几丁质(Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1-4-糖苷键链接而成的线性多聚糖[1],在自然界中几丁质是昆虫表皮的重要组成部分,参与昆虫表皮几丁质的降解,在昆虫的脱皮发育与生命活动中起着关键作用[2]。几丁质酶是能够降解几丁质的关键酶之一,昆虫的几丁质酶属于GH18家族的内切酶,主要存在于昆虫的体壁,脂肪体等组织,能够把几丁质水解成N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚物[1]。
  蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是引起蜜蜂真菌传染病——白垩病(Chalkbrood disease)病原。昆虫病原真菌能通过分泌几丁质酶、蛋白酶等多种水解酶,来达到降解昆虫肠道围食膜和体壁几丁质保护层的作用。昆虫病原真菌超量表达几丁质酶和蛋白酶基因会提高菌株的毒力[3]。因此,对球囊菌几丁质酶基因进行鉴定和分析,将有助于了解几丁质酶在病原真菌入侵昆虫中的功能。
  本研究对球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578进行克隆鉴定,通过生物信息学方法预测该基因编码的氨基酸序列和3D的结构特征,分析其蛋白在几丁质酶家族成员中的分类和系统进化关系,以便为深入探讨球囊菌几丁质酶在入侵昆虫过程中的作用和以后防治措施提供基础资料。
  1.材料与方法
  1.1材料及主要试剂
  RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等试剂购自TaKaRa公司,胶回收试剂盒、PCR试剂盒、连接酶、抗生素等试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
  1.2 DNA样本制备
  培养和纯化球囊菌,加酒精,灭菌双蒸馏水清洗3次,吸干。将组织放入液氮研磨充分后转入离心管,56℃水浴1h,5-6min颠倒一次,用CTAB法提取DNA,700μL 2% CTAB,20μL 10% SDS,40μLβ-巯基乙醇,20μL 蛋白酶K。12000r/min离心,10min, 吸取上清,加等体积事先配好的苯酚、氯仿、异戊醇,比例为25:24:1,强烈混匀3min,然后12000r/min离心,5-10min。取上层溶液,加等体积氯仿,异戊醇,比例为24:1,12000r/min离心5min。取上层溶液,加2/3体积异丙醇,1/10提及的5mol/L PH5.2醋酸钠,轻混1min,-20℃沉淀1h,12000r/min离心5min。弃上清,加70%乙醇1mL漂洗,12000r/min离心3-10min,加60μL TE Buffer,0.6μL RNA酶,封口膜封号,37℃孵育摇床30min,电泳检测,-20℃保存备用。
  1.3 目的基因PCR扩增
  根据球囊菌中几丁质酶基因的参考序列,设计特异性引物,引物序列为:F:GGGGTACCATGATGTTCTCTAAGCTTTC; R:CCGCTCGAGCCGGGCTTGACAACTTTGCA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
  以DNA为模板进行PCR扩增,TaqPCR 72μL;上,下游引物(mol/L)各6μL;DNA模板6μL,灭菌双蒸馏水60μL。PCR反应程序:94℃预变4min;94℃变40s;59.2℃退火40s;72℃延伸10 min,35个循环。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
  1.4目的基因克隆及序列分析
  用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的基因片段,链接T载体,16℃恒温仪上连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,含LB琼脂平板筛选,选取阳性菌落37℃氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板筛选,选取阳性菌落37℃培养12~16h,用質粒提取试剂盒提取重组质粒,经 PCR 鉴定正确后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
  1.5 生物信息学分析
  利用NovoPro将DNA序列翻译成氨基酸序列,然后利用Mega7.0和ClustalX与(Tc-NP_001034524.1; Tc-NP_0010
  36067.1; Tc-NP_001036035.1; Ag-XP_315650.4; Ag-XP_0016
  87765.2; Dm-NP_611542.2; Am-XP_006572082.1)6个代表物种的几丁质酶序列进行同源性比对与进化树分析。采用SWISSMODEL软件(https://www.swissmodel.expasy.org)预测蛋白质三级结。
  2.结果
  2.1 PCR扩增结果
  采用球囊菌几丁质酶基因Am-KZZ89578特异性引物对其DNA样本进行PCR扩增,扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测,结果发现目的条带长约958bp,与预期片段大小一致,说明实验已成功扩增出球囊菌几丁质酶基因。
  图1 球囊菌几丁质酶Am-KZZ89578基因PCR分析
  2.2 目的基因测序结果
  回收目的基因进行克隆与鉴定后,对养性重组质粒进行测序,结果见图,由图,球囊菌几丁质酶基因全长958 bp,编码421个氨基酸。